Диплом: Біохімія трансгенної картоплі в умовах України

Диплом: Біохімія трансгенної картоплі в умовах України

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АГРОНОМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра захисту рослин

Завідувач кафедрою_____________________

А.К.Мішньов

ДИПЛОМНА РОБОТА

на тему: «Біохімія трансгенної картоплі в умовах

України»

Для одержання кваліфікації спеціаліста

за спеціальністю 7.130105 – Захист рослин»

експертизи ________________ (Жатова Г.О.)

Консультант з питань

техніки безпеки _________________ (Шандиба О.Б.)

Суми - 2001

ЗМІСТ

Вступ

..................................................................................................................

1. Огляд літератури........................

1.1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів

рослин родини Solanaceae............................................

1.1.1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова...........

1.1.2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки..............

1.1.3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних,

грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів

картоплі..........................

2. Природні умови

господарства.................................................................

.....

3. Методика проведення

досліджень..............................................................

4. Результати

досліджень...................................................................

..............

5. Охорона

праці........................................................................

.......................

6. Охорона навколишнього

середовища.......................................................

Висновки

..........................................................................................................

Список використаної літератури

...............................................................

ВСТУП

Підвищений “тиск” на організм людини ксенобіотичних сполук природного та

штучного походження обумовлює необхідність поглибленого вивчення таких сполук,

і в першу тих із них, котрі входять до складу найбільш поширених харчових

продуктів, зокрема картоплі. Глікоалкалоїди картоплі являють собою групу

вторинних метаболітів, яким притаманні найрізномантніші види біологічної

активності [ ]. Так, дослідами in vitro доведена здатність цих сполук

спричинювати хромосомні аберації, порушувати цілісність ліпосом та природніх

біомембран тощо [ ]. Останнє свідчить на користь того, що глікоалкалоїдам

притаманна потенційна мутагенна і, можливо, канцерогенна активність [ ].

Виходячи з наведеного, цілком природньою є підвищена зацікавленість в

дослідженні глікоалкалоїдів з боку фахівців в галузях медичної токсикології і

генетики людини, тим більше, що в останні роки на світовий ринок виходять нові

сорти продовольчої картоплі, отриманої як шляхом “класичної” селекції за участі

дикоростучих видів роду Solanum [ ], так і за допомогою генетичної інженерії

(New LeafÒ, Monsanto, США). Обидва підходи не виключають

біосинтезу в тканинах рослин картоплі, зокрема бульбах, окрім характерних для

культурної картоплі глікоалкалоїдів a-Соланіну та a-Чаконіну “мінорних”

глікоалкалоїдів (солакаулін, соласолін, соламаргін, деміссін, томатін, лептін І

і ІІ, лептінін-І і ІІ тощо), які ведуть походження з дикоростучих попередників,

або синтезуються de novo [ ]. Останнім притаманні токсикологічні

характеристики, відмінні від добре відомих аналогічних показників a-Соланіну та

a-Чаконіну. Якщо прийняти до уваги встановлений факт щодо синергетичного

багаторазового підсилення біологічної активності суміші двох різних за хімічною

структурою глікоалкалоїдів [ ], то стає цілком обгрунтованою необхідність

досліджень кількісних та якісних показників глікоалкалоїдів продовольчої

картоплі паралельно з селекцією та молекулярною інженерією, успішність яких

залежить від наявності нових високочутливих методів фізико-хімічного аналізу.

Складність аналізу сумарної фракції глікоалкалоїдів з рослин картоплі

пов’язана, зокрема з тим, що субфракція “мінорних” глікоалкалоїдів не перевищує

за масою 0,5-5% [ ].

Останнім часом в аналізі біомолекул набули широкого розповсюдження методи

м’якоіонізаційної мас-спектрометрії, зокрема плазмено-десорбційна

мас-спектрометрія (PDMS). Зважаючи на це, нами зроблена спроба проаналізувати

фракцію глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6

Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic за допомогою PDMS мас-спектрометрії.

Atlantic новітнім мас-спектрометричним методам.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей

глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceaе

Рослини картоплi культурних та диких видів мiстять серед численних органiчних

сполук групи вторинних метаболітів глiкоалкалоїди [ ], найважливiшими з

яких є a-соланiн, a-чаконiн, деміссин, лептіни I,II,III, соламарін,

коммерсонін [ ]. Фiзiологiчнi функцii глiкоалкалоїдiв пов'язанi з явищем

стiйкостi рослин картоплі проти фiтопатогенiв i шкiдникiв [ ]. Крiм того,

глiкоалкалоїди беруть безпосередню участь в бiохiмiчних процесах, які

притаманні тканинам листкiв, пагонiв, квiток, бульб рослин картоплi

(цвiтiння, видова сумiснiсть, утворення насiння); обумовлюють разом з iншими

вторинними метаболiтами смаковi якостi та придатнiсть картоплi для переробки

[ ], а також мають певне значення як токсичні, ембріотропні і канцерогеннi

сполуки природнього походження [ ]. Зважаючи на це, багато перспективних

за врожайнiстю та iншими господарсько-корисними якостями сортiв картоплi не

були рекомендованi для широкого використання саме завдяки пiдвищеному вмiсту

глiкоалкалоїдiв [ ]. На думку вiтчизняних та зарубiжних [ ] дослiдникiв,

кiлькiснi та якiснi характеристики глiкоалкалоїдiв нових сортiв i гiбридiв

картоплi заслуговують на поглиблене вивчення. Одним з найважливіших питань,

пов’язаних з біохімією та фізіологією глікоалкалоїдів, яке і досі не знайшло

однозначного вирішення, є встановлення корелятивних зв’язків між параметрами

метаболізму глікоалкалоїдів та ступенем стійкості сортів картоплі проти

шкідників і фітопатогенів [ ]. Іншим дискусійним питанням є

невизначеність зв’язків між кількісним накопиченням глікоалкалоїдів в

тканинах рослин картоплі різних сортів, зокрема бульбах і умовами вирощування

(погодно-кліматичні умови протягом конкретного вегетаційного сезону, тип

грунтів, удобрення тощо), а також умовами зберігання (температура,

освітленість, вологість тощо)[ ]. На думку провідних вчених дискусійні та

суперечливі результати в цьому напрямку дослідження отримані тому, що, по-

перше, на інтенсивність біосинтезу вторинних метаболітів взагалі і

глікоалкалоїдів зокрема, різноспрямовано впливає велика кількість факторів

зовнішнього середовища і це, разом з підвищеною лабільністю та чутливістю

ферментних систем метаболізму глікоалкалоїдів до зазначених факторів

обумовлює суттєві розбіжності, про які згадувалось вище; і, по-друге,

більшість ранніх робіт були проведені без урахування різноманітності

глікоалкалоїдів за хімічною структурою – в межах цих досліджень визначали

тільки їх сумарну кількість ваговим або колориметричним методами [ ].

Проте, глікоалкалоїди картоплі являють собою досить велику групу сполук, до

складу якої входять «мажорні» (a-соланiн та a-чаконiн у культурних видів

картоплі) і численні «мінорні» (b-соламарін, деміссидін, 5b-соланідан-3a-ол,

томатіденол) компоненти. Крім того, тканини рослин картоплі містять

спеціалізовані ферментні системи, які модифікують інтактні молекули

глікоалкалоїдів з утворенням численних проміжних сполук, фізіологічна роль яких

вичерпно не з’ясована (b-соланін, b-чаконін, g-соланін, g-чаконін тощо)[ ].

Таким чином, дослідження статичних і динамічних кількісних та якісних

параметрів глікоалкалоїдів рослин картоплі різних сортів в процесах вирощування

в умовах конкретних кліматичних зон, зберігання та переробки, а також під

впливом фітопатогенів, мають певні перспективи за умов використання з метою

аналізу цих сполук нових високоінформативних фізико-хімічних методів досліджень

[ ]. В Сумському ДАУ та Інституті прикладної фізики НАНУ (м.Суми) в

1994-2000 рр. в межах проекту «М’якоіонізаційна мас-спектрометрія в

агробіології» провели цикл досліджень глiкоалкалоїдів рослин картоплi за

допомогою новiтнього фiзико-хiмiчного методу аналізу полярних, термолабільних,

нелетючих органiчних сполук – плазмено-десорбційної часопрольотної

плазмено-десорбцiйної мас-спектрометрiї з iонiзацiєю уламками подiлу 252

Cf (МС-ПДМС)[ ].

Алкалоїди являють собой велику групу рослинних речовин різного хімічного

складу, яким притаманна специфічна дія на організм ссавців та людини.

Алкалоїди є азотовміськими гетероциклічними сполуками, що містять в своєму

складі атом азоту. Загальною властивостю даної групи речовин є їх надзвичайно

сильна фізиологічна дія на організм тварин та людей. Більшість алкалоїдів

діють на нервову систему: в невеликих дозах здійснюють збуджуючий вплив, в

великих - пригнічують, а в ще більших є сильнодіючими отрутами [ ].

Фізіологічне значення алкалоїдів в життєдіяльності самих рослин досі не

з`ясовано. До цього часу не вдалося ще з великою достовірностю показати місце

алкалоїдів в життєво важливих процесах обміну речовин, з іншого боку немає

неспростовних доказів того, що алкалоїдоносні види рослин можуть існувати без

алкалоїдів [ ].

В ряді робіт відзначається вплив алкалоїдів на обмін речовин у рослин,

виникнення квітів, формування органел та органів рослин, ріст клітин, поділ

ядер і т.д. Було доведено, що алкалоїди в клітинах рослин якимось чином

ізольовані від внутрішнього середовища клітини. Так, розчини нікотину, нанесені

на рослинні тканини табаку, чинять всебічну негативну фітотоксичну дію навіть

при концентрації, рівній їх концентрації в тканинах. Доведено, що високий вміст

алкалоїдів часто пов`язаний зі зниженням сили росту рослин. Інакше кажучи, у

рослин в період вегетації та спокою існує тісний взаємозв`язок: «білковий

азот - алкалоїди». Цими причинами, на думку Горяєва, пояснюється зміна

складу алкалоїдів, а в деяких випадках і їх повна відсутність в тканинах

алкалоїдних рослин (Solsola richteri. Girgensonia Oppositiflora. Anabasis

turkestanika) [ ].

1.1. 1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова.

Глікоалкалоїди, які містяться в бульбах картоплі, раніше називали загальним

терміном «соланін». В наш час встановлено, що так званий «соланін» являє

собою суміш якнайменше 6 різних глікозідних сполук: a-, b-, g-соланіна та a-

, b-, g-чаконіна. Ці сполуки мають один і той же аглікон («корове ядро») –

соланідин і відрізняються між собою складом глікозидного ланцюжка (Рис.1).

Трисахаріди - a-соланін і a-чаконін є основними формами і складають в

тканинах картоплі біля 95% усієї суми глікоалкалоїдів групи соланіна [

]. Крім a-, b-, g-соланіна та a-, b-, g-чаконіна, відомі інші глікоалкалоїди

пасльонових: солакаулін, соласолін, соламаргін, демісін, томатін, лептін,

лептінін-1, лептінін-2 та інші. Всі гликоалкалоїди складаються з двох

основних складових, виникаючих при кислотному гідролізі цих речовин –

аглікона, який і є власне «алкалоїдом», і декількох моносахарів, які

знаходяться в молекулі глікоалкалоїда в вигляді глікозідного ланцюга,

зв`язаного з агліконом [ ]. Глікоалкалоїди культурної та дікої картоплі

(Solanum) можна систематизувати в окремі групи. До групи соланідіна

відносяться: a-, b-, g-соланін та a-, b-, g-чаконін, солакаулін і

глікоалкалоїд, виділений з групи Akaulia. Іншу групу алкалоїдів складають

сполуки, агліконом яких є соласодін. Сюди входять соласонін і соламаргін.

Соласонін і соламаргін є основними алкалоїдами Solanum nigrum, Solanum

laciniatum більшості інших видів Solanum

[ ].

Соласодамін знайдений в листках Solanum auriculatum і Solanum magrinatum. В

групу, яка містить в якості аглікона демісідін, входить демісин, знайдений у

Solanum demissum і глікоалкалоїд, виділений із Solanum polyadenium. Лептіни –

глікоалкалоїди,

Рис.1. Хімічна структура агліконів, знайдених в рослинах картоплі [ ].

знайдені Куном і Левом, виявлені у Solanum chacoense. Групи Eutuberosa,

Andigena, і Commersonia містять тільки - соланін, ці види містять також

чаконін. Ці два глікоалкалоїди зустрічаються завжди разом, що доведено

хроматографічними дослідженнями. Демісин присутній в рослинах групи Demissa і

Acaulia, за виключенням Solanum acaulia, в складі якого знайдено солакаулін.

Демісин знайдений також у Solanum jamesii. У форм, які не дають бульб, крім

a-соланіна, який і тут частіше всього зустрічається, найбільшу групу

складають форми, які містять томатін. І тільки єдина форма Solanum

poliadenium, яка створює бульби, містить томатін. Інші алкалоїди

зустрічаються тільки в деяких форм, нприклад, соласодамін – у Solanum

sodomaneum i Slanum aviculare.

Всі алкалоїди картоплі належать до стероїдної групи похідних

циклопентанопергідрофенантрена і складаються з алкалоїда (аглікона) та цукру,

зв’язаного з ним глікозідним зв’язком. Аглікон має стероїдну будову, містить

атоми азоту, який утворює третинну або вторинну аміногрупу. Прикладом першого

типу являється соланідін, другого-томатідін і соласодін. Глікозідна частина

являє собою моно-, ді-, три-, і тетрасахаріди; до їх складу може входити

глюкоза (Glu), галактоза (Gal), рамноза (Rha) і ксілоза (Xyl). Наприклад,

a-соланін складається з аглікона-соланідіна і трисахаріда, який при гідролізі

кислотою розпадається на галактозу, глюкозу і рамнозу. Соланін має

розгалужений сахарний ланцюжок: безпосередньо з агліконом зв`язана галактоза,

а глюкоза і рамноза складають бокові ланцюги. Подібну будову мають глікозідні

частини глікоалкалоїдів демісіну, томатіну, a-чаконіну, соласодіну і

соламаргіну [ ].

Під впливом гідролізу глікоалкалоїди розпадаються на цукор і аглікон, фізичні

і хімічні властивості якого і вказують на велику схожість його зі стероїдами.

Стероїди утворюють різноманітну групу важливих природних речовин. Сюди

відносяться стеріни, жовчні кислоти, гормони розмноження, вітаміни групи Д,

глікозиди, різні алкалоїди і інші речовини. Базовою структурою усіх стероїдів

є стеран (циклопентанопергідрофенантрен).

До класу стероїдів належать також фітостерини: сіто-, стігма-, і кампестерін,

холестерін, ергостерін, жовчні кислоти.

Сполуки стероїдів з сахаром належать до групи глікозідів. В цю групу, крім

глікоалкалоідів, входять «сердечні глікозіди», які містяться в деяких

рослинах із родини Strophanthus і Digitalis. Стероїдні саконіни також являють

собою глікозіди агліконів, котрі э похідними циклопентанопергідрофенантрена.

Сапоніни не містять в своєму складі атом азоту [ ].

Одним з доказів схожості аглікона глікоалкалоідів зі стероїдами є те, що їх

можливо перетворити в метилциклофенантрен. Ця сполука синтезується тим же

шляхом із стероїдів. При третьому атомі вуглецю аглікона знаходиться група,

яка може сполучатися глікозідно з моносахаридами. Остаточно стероїдну будову

аглікона вдалося довести, коли похідне аглікона отримали з відомих стероїдів

і, навпаки, похідні стероїдів- із аглікона глікоалкалоїдів; наприклад, із

безазотної речовини криптогеніна - соласодін, із соласодіна - стероїдний

сапогенін - діосгенін. Веліка схожість з сапонінами виявляється і в будові

сахарної частини глікоалкалоідів. Загальною властивістю сапонинів і

глікоалкалоідів являється їх гемолітична дія [ ].

Таким чином, основними глікоалкалоїдами культурної картоплі є a- соланін та

a-чаконін. Всі глікоалкалоїди різних видів картоплі складаються з двох

основних частин: аглікона (алкалоїда), який має стероїдну будову, і молекули

сахару, в склад якої входять моно-, ді-, три-, або тетрасахариди.

1.1.2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки

Глікоалкалоїди соланін та чаконін в невеликій кількості розглядається як

цілком можливі компоненти бульб картоплі, при надмірній кількості вони

погіршують смакові якості картоплі. У бульб з`являється гіркуватий смак, при

вживанні таких бульб в харчування віникають чуття зуду в горлянці [ ].

Встановлена визначена кореляція між наявністю глікоалкалоїдів і

органолептичними смаковими якостями вареної картоплі. При дуже низькому

вмісті глікоалкалоїдів в бульбах (порядку 1-5 мг%) смак вареної картоплі

трохи гірший, ніж при середньому (5-10 мг%). Але збільшення їх вмісту вище за

26 мг% на сиру речовину дуже погіршує смак вареної картоплі і стає

небезпечним для здоров`я людини [ ].

Бульби картоплі, які містять ніж 20 мг% глікоалкалоїдів, не рекомендується

вживати в харчування, осбливо коли картопля вареться зі шкірочкою. Почищені

бульби менш небезпечні, так як значна частина глікоалкалоїдів видаляється зі

шкірочкою, а частина переходить в воду, при варинні ж неочищених бульб цього

не відбувається вз`язку з слабкою проникністю шкірочки. За даними

М.Г.Шевченко [ ], нйбільшу небезпеку для здоров`я становить нерозчинний в

воді соланін, зосереджений в основі пророслх вічок.

1.1.3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових

захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі.

Глікоалкалоїди привертають увагу селекціонерів-картоплярів в зв`язку з їх

токсичною дією на бактеріальні та грибкові захворювання картоплі, а також в

зв`язку з токсичною дією на колорадського жука [ ].

Встановлено, що соланін затримує ріст бактерій, а 0,1-0,5% -ний розчин його

викликає відмирання протоплазми. Виділені фунгіцидні якості глікоалкалоїдів в

відношенні ряду патогенних грибів, таких як Microsporum audoine,

Trichophyton gypseum, Fusarium oxуsporum, зооспор Phytophthora infestans,

Helminthosporum carbonum.

В Інституті біохімії РАН досліджували фунгіцидні властивості глікоалкалоїдів

і інших сполук картоплі, наділених антибіотичними якостями, а також вивчали

дію механічних пошкоджень і зараження Phytophtora infestans на утворення і

розподіл глікоалкалоїдів в тканинах бульб [ ]. Виявилось, що

глікоалкалоїдам a-соланіну та a-чаконіну притаманна більша фунгіцидна

активність ніж фенолам (кофейній і хлорогеновій кислотам). Так, в

концентрації 0,1 мг/мл останні не впливали на кінетичні показники росту

фітофтори, тоді як глікоалкалоїди пригнічували його майже на 70%. Зооспори

цього паразита гинули вже при концентрації a-соланіна 5 мкг/мл.

Соланин, чаконін і соланідін інгібують радіальний рост Alternaria solani на

картоплі. По ступеню інгібування на першому місці стоїть соладінін, потім

чаконін і соланін. При концентрації 500 мг/л соланін викликає 50% інгібування

росту після 96-годинного періоду інкубації при 24оС. Встановлено

наявність збільшення чутливості листків до розвітку пошкодження яке

супроводжується зменшенням концентрації глікоалкалоїдів в листках в міру їх

старіння. Наприклад, 30-денні листки сорту Катадин містять 950 мг/кг

глікоалкалоїдів і стійкі до паразиту, тоді як старіючі 90-денні листки містять

тільки 150мг/кг глікоалкалоїдів і значно уражаються грибом [ ].

Проте подальші дослідження показали, що хоча глікоалкалоїди і наділені

фунгітоксичністю, вони все ж таки не є вирішальним фактором в явищі

фітоімунітета картоплі [ ]. Взагалі після інфікування в бульбах картоплі

накопичується хлогенова та кофейна кислоти, скополетин, a-соланін, a-чаконін,

рішитин, фітуберин. Всі зазначені сполуки, за виключенням рішитіна та

фітуберіна, присутні в шкірочці бульби в кількостях рівних або більших, аніж

синтезованих за умов інфікування патогеном очищеної картоплі. Хлорогенова та

кофейна кислоти знайдені в усіх частинах рослини. Вони продукуються в

бульбах картоплі в результаті пошкоджень та інфекції багатьма патогенними та

не патогенними організмами і накопичуються (або присутні) в деяких здорових

тканинах рослини картоплі в кількостях, які можуть пригнічувати

мікроорганізми. Механічне пошкодження чи інфекція викликає швидке окислення

цих речовин, а продукти окислення токсичні для багатьох мікроорганізмів. На

ранніх стадіях інфекції після інокуляції бульб деякими расами фітофтори

накопичуються поліфеноли. В тканинах, інокульованих несумісними расами

фітофтори, або в зрізах накопичується тільки хлорогенова кислота.

Глікоалкалоїди a-соланін і a-чаконін зосереджуються біля пошкоджених ділянок

бульби [ ]. Про те, що глікоалкалоїди не є вирішальним фактором в

імунітеті картоплі, свідчать результати дослідів, проведених на раневій

перидермі бульб. В зараженій фітофторою раневій тканині картоплі

глікоалкалоїди не накопичуються. Звідси виходить припущення, що фітофтора

наділена здатністю руйнувати глікоалкалоїди.

В раневій тканині, зараженій несумісною расою фітофтори, не відбувається

накопичення глікоалкалоїдів, не виявляються фітоaлексини рішитин і любімін. В

непошкодженій паренхимі бульб не синтезуються ні глікоалкалоїди, ані

фітоалексіни. В раневій перидермі весь мевалонат використовується на синтез

глікоалкалоїдів. В відмерлій тканині, навпаки. Утворення глікоалкалоїдів

майже не відбувається, а мевалонат використовується для синтезу рішитіна та

любіміна. В зараженій тканині, як і в раневій, глікоалкалоїди хоча і

утворюються, але розкладаються фітофторою [ ].

В США проводили роботи по виведенню сортів картоплі, наділених полігенною

стікістю до фітофтори, при цьому стикалися з труднощами, обумовленими

отриманням гібридів з високим вмістом в бульбах глікоалкалоїдів. Дослідження,

проведені в селекційному центрі штата Західна Віргінія, на 15 клонах

картоплі, наділених різною ступеню полігенної стійкості до фітофтори і трьох

стандартних сортах, не підтвердили наявність взаємозв`язку між зазначеною

стійкістю і вмістом в бульбах глікоалкалоїдів. В результаті прийшли до

висновку, що можливе створення нових сортів картоплі з полігенною стійкістю

до фітофтори і звичайним, або зниженим вмістом глікоалкалоїдів в бульбах.

Встановлена висока ступінь кореляції (r=0,82) між вмістом глікоалкалоїдів в

листках та бульбах випробуваного селекційного матеріалу [ ].

Дослідженнями Куна було встановлено, що непоїдання листків дикого виду

картоплі Solanum demissum колорадським жуком обумовлена наявністю в них

глікоалкалоїда демісіна [ ]. Це спонукало вітчизняних ботаніків

організувати експедицію в країни Південної Америки для пошуків диких видів

картоплі, стійких до колорадського жука. Під час експедиції було знайдено

біля 10 таких видів, частина з них використовується в селекції при виведенні

нових сортів картоплі.

Глікоалкалоїди бульбоносних виді