Диплом: Генетические основы устойчивости линий и сортов озимой мягкой пшеницы к возбудителю бурой листовой ржавчины Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp. tritici

Диплом: Генетические основы устойчивости линий и сортов озимой мягкой пшеницы к возбудителю бурой листовой ржавчины Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp. tritici

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И. И. МЕЧНИКОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра генетики и молекулярной биологии

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА УСТОЙЧИВОСТИ ЛИНИЙ И СОРТОВ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ К

Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp. tritici

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА МАГИСТРА

студентки V курса дневного отделения

Залогиной Марии Анатольевны

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник

Кожухова Наталия Эдуардовна

Научный консультант:

кандидат сельскохозяйственных наук

старший научный сотрудник

Бабаянц Лазарь Тигранович

Допущена к защите Защищена на

заседании ГЭК

______________2004 г.

___________________2004 г.

Протокол заседания с

оценкой________________

кафедры № _______ Протокол

№______________

Зав. кафедрой Секретарь

ГЭК ___________

_________________

ОДЕССА 2004

РЕФЕРАТ

Дипломная работа изложена на 54 страницах машинописного текста, включает 7

таблиц, 1 рисунок. Список литературы включает 75 работ, из них 48 зарубежных

авторов.

Цель дипломной работы – установить генетическую основу устойчивости озимой

мягкой пшеницы сортов Bayden, Tomo, Welton, и линий 5/37-91 и 2-3/99 к

Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp. tritici.

Объект исследований – генетическая детерминация иммунитета растений к инфекциям.

Предмет исследований – гены, обусловливающие устойчивость растений озимой

мягкой пшеницы к бурой листовой ржавчине. Исследования проводились в филиале

кафедры генетики и молекулярной биологии Южного биотехнологического центра в

растениеводстве УААН и МОН Украины, и в отделе фитопатологии и энтомологии

Селекционно-генетического института УААН (г. Одесса).

Изучали устойчивость сортов Bayden, Tomo, Welton, и линий 5/37-91 и 2-3/99 к

патогену, руководствуясь общепринятыми методиками. Проводили гибридизацию,

скрещивали изучаемые сорта и линии с сортами, не имеющими генов устойчивости;

получали семена F1, F2, F1ВС1.

Генетическую основу устойчивости к возбудителю бурой листовой ржавчины

изучали классическим методом гибридологического анализа. Устанавливали

количество генов, их идентичность проверяли, используя тестирующие расы

патогена.

Проведенные исследования позволили установить, что сорта Bayden, Tomo,

Welton и линии 5/37-91 и 2-3/99 обладают устойчивостью к возбудителю бурой

листовой ржавчины. Эти сорта можно использовать в селекции пшеницы как

доноры эффективных Lr-генов.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.............................

1. Обзор литературы.........................

1.1. Общие сведения о бурой листовой ржавчине.............

1.1.1. Цикл развития бурой листовой

ржавчины...........................................

1.2. Специализация и расовый состав....................

1.3. Генетические основы устойчивости пшеницы к

фитопатогенам................................

1.3.1. Гипотеза Флор «ген на ген»....................

1.3.2. Генетические концепции взаимоотношений

растений-хозяев и паразитов.....................

1.3.3. Гены устойчивости и типы их взаимодействий............

1.3.4. Генетические основы типов устойчивости к

фитопатогенам................................

1.3.5. Lr-гены устойчивости к возбудителю бурой листовой

ржавчины...............................

1.4. Селекция на устойчивость к фитопатогенам................

2. Собственные исследования......................

2.1. Материалы и методика......................

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.............

Заключение...............................

Выводы................................

Используемая литература.........................

ВВЕДЕНИЕ

[Пересыпкин, 1979].

В борьбе с бурой листовой ржавчиной применяются методы интегрированной

защиты, среди которых создание и возделывание устойчивых сортов пшеницы

является основным [Бабаянц, 1988]. К сожалению, устойчивость со временем

теряется. Это связано с тем, что у патогена в результате половой гибридизации

и других парасексуальных процессов появляются вирулентные биотипы и расы,

способные преодолевать эту устойчивость.

Количество эффективных Lr-генов устойчивости к возбудителю бурой листовой

ржавчины с каждым годом сокращается [Бабаянц, 1990; Трасковецька, 1998].

Необходим постоянный поиск таких генов. Он является актуальным и значимым для

селекции.

Источниками эффективных Lr-генов являются сородичи пшеницы – дикие и

культурные виды злаков [Животков, 1993]. Во многих странах, в т.ч. Украине,

ведется селекционная работа по интрогрессии в пшеницу таких Lr-генов в

результате межвидовой гибридизации. Созданные линии и формы пшеницы являются

исходным селекционным материалом и используются в дальнейшем в качестве

доноров устойчивости. Как доноры устойчивости могут использоваться и уже

созданные сорта, как в Украине, так и в других странах.

Для обоснованного использования в селекции доноров устойчивости необходима

информация об их основных признаках и свойствах. Прежде всего, важны сведения

об их генетической основе устойчивости – генах устойчивости, их действии,

взаимодействии, экспрессии, эффективности к наиболее распространенным и

агрессивным расам патогена.

В отделе фитопатологии и энтомологии Селекционно-генетического института

(СГИ) проводится изучение сортов пшеницы различных стран с целью выделения из

них высокоустойчивых к возбудителям различных заболеваний, в т.ч. бурой

листовой ржавчины. В последние годы выделены устойчивые, происходящие из

различных стран сорта.

Целью настоящей работы является установить генетическую основу устойчивости

сортов Bayden, Tomo, Welton (Англия) и линий 5/37-91 и 2-3/99 (СГИ) к

возбудителю бурой листовой ржавчины.

Для достижения поставленной цели, задачами исследований являются:

1. Провести фитооценку устойчивости сортов к вирулентным и наиболее

агрессивным расам патогена

2. Провести гибридизацию и получить семена F1, F2 и F1BC1 для

гибридологического анализа.

3. По результатам фитооценок провести гибридологический анализ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о бурой листовой ржавчине

Царство: Fungi

Класс: Teliomycetes

Порядок: Uredinales

Семейство: Pucciniaceae

Род: Puccinia

Вид: Puccinia recondita

Forma: sp. tritici

Бурая листовая ржавчина – очень распространенное и вредоносное заболевание

пшеницы во многих районах Украины. Частые эпифитотии ее бывают в Лесостепи и

Полесье Украины и на орошаемых землях.

Проявляется главным образом на листьях, реже на листовых влагалищах и очень

редко на стеблях. Сначала преимущественно на верхней стороне листьев

появляются рассеянно (иногда кольцеобразно) ржаво-бурые более или менее

овальные урединии длиной 1 – 2 и шириной 0,5 мм. Они прикрыты эпидермисом,

который вскоре разрывается, обнажая большое количество уредоспор. При сильном

поражении растений урединиями покрывается почти вся листовая пластинка, и

тогда листья скручиваются и быстро усыхают. На растениях сортов с повышенной

чувствительностью к патогену вокруг урединий образуются хлоротические и

нехлоротические пятна. Через10 – 15 дней после появления урединий

преимущественно на нижней стороне листовой пластинки образуются слегка

удлиненные черные телии с телиоспорами, прикрытые эпидермисом.

Возбудитель болезни – двудомный гриб Puccinia reconditа f. sp. tritici Rob

ex Desm. Его уредоспоры шаровидные или эллипсоидальные, 17 – 29 х 16 – 24

мкм, с желто-оранжевым содержимым. Оболочка уредоспор желто-бурая, густо

покрытая маленькими шипиками с узкими проростковыми порами.

Телиоспоры двуклеточные, темно-коричневые, в массе черные, булавовидные, 32 –

49 х 14 – 22 мкм, на вершине их оболочка более темная.

Различают две формы гриба: европейскую и сибирскую. Европейская форма характерна

для Украины. В природных условиях он почти не дает эцидиального спороношения.

Очень редко эцидии с эцидиоспорами можно обнаружить на василистнике (

Tallictrum vulgare) и лещице дымянковидной (Isopyrum fumarioides L.)

В Украине гриб зимует в уредостадии (чаще в виде уредогрибницы) на озимой

пшенице. Заражение пшеницы возможно в широких температурных пределах, так как

уредоспоры при наличии капельной влаги прорастают при температуре от 2,5 до 31

градусов. Оптимальной считается температура 15 - 25 градусов. При наличии росы

и температуре 5 градусов растения заражаются за 7 часов, а при 15 – 20 градусах

менее чем за 4 часа.

Инкубационный период болезни при температуре воздуха 4 – 25 градусов длится

от 18 до 5 дней. За период вегетации пшеницы патоген образует несколько

генераций урединий с уредоспорами, чем и объясняется сильное нарастание

заболевания к началу молочно-восковой спелости растений.

Уредогрибница с уредоспорами, образовавшиеся осенью, относительно стойки к

низким температурам, поэтому заболевание проявляется весной и в дальнейшем

прогрессирует, достигая максимума в фазе молочно-восковой спелости зерна. В

летний период жизнеспособность уредоспор непродолжительна, так как в теплую

погоду и при наличии влаги они быстро прорастают. При высокой температуре и

низкой относительной влажности воздуха уредоспоры быстро теряют

жизнеспособность. В южных районах Украины, в т. ч. в Одесской области, где

между периодом уборки урожая и посевом озимых проходит 1,5 – 3 месяца,

основная масса уредоспор погибает. Здесь источником инфекции являются

зараженные всходы падалицы пшеницы. В более северных районах уредоспоры могут

распространяться из остатков жнивья на новые всходы и заражать их

[Пересыпкин, 1989].

Накоплению инфекционного материала способствуют теплая и влажная погода в

сентябре – октябре предыдущего года, относительно теплая зима, а также

интенсивное выпадение осадков весной и в первой половине вегетации растений в

фазе колошения.

В Сибири гриб зимует в виде телиоспор па пожнивных остатках, а весной

основным источником заражения яровых пшениц являются эцидиоспоры,

образующиеся на лещице дымянковидной и василистнике (сибирская форма).

В условиях Украины основными зонами вредоносности бурой ржавчины являются

Лесостепь и Полесье. Большую угрозу представляет бурая ржавчина и для Юга

Украины. Установлено, что возбудитель бурой листовой ржавчины обладает

широкой специализацией и, кроме пшеницы может развиваться на пырее ползучем,

житняке черепитчатом, костре кровельном, костре мягком, овсянице луговой,

эгилопсе цилиндрическом и обыкновенном, мятлике узколистном.

Роль дикорастущих трав как резерваторов и источников распространения инфекции

возрастает в весенний период, так как развитие ржавчины на них начинается на

7 – 10 дней раньше, чем на посевах пшеницы, а также в период после уборки

стерневых остатков пшеницы до появления всходов озимых.

Вредоносность заболевания проявляется в уменьшении ассимиляционной

поверхности, повышения транспирации с полным нарушением водного баланса, что

является причиной преждевременного отмирания листьев. Пораженные бурой

ржавчиной растения озимой пшеницы с осени имеют слабую зимостойкость,

снижается и их засухоустойчивость. При сильном поражении растений в колосьях

образуется меньше зерен, они имеют низкое качество, легковесны, что является

основной причиной недобора урожая.

1.1.2. Цикл развития бурой листовой ржавчины пшеницы

Цикл развития Puccinia recondita f.sp. tritici ,если его изучать во всех

деталях, представляется в таком виде. Инфицирование злака уредоспорой

происходит всегда через устьице. При прорастании споры образуется аппрессорий,

вслед за тем во внутренней полости устьица, в тесном контакте с внутренней

поверхностью замыкающих клеток, образуется пузыревидное расширение гифы,

заключающее от 4 до 8 ядер. Некоторый процент таких аппрессориев не дает

внутреннего роста, и инфицирование не происходит, о чем можно уже судить по

прошествии 40 часов после нанесения инфекционного материала. Иногда же, при

обилии нанесенных уредоспор, происходит внедрение двух ростков в одно и то же

устьице. Затем развивается инфицирующая гифа, растущая прямо вниз, поперек

воздушной камеры под устьицем, перпендикулярно поверхности листа. Цитоплазма и

ядра из уредоспоры перекочевывают в эту гифу, оставляя упомянутое пузыревидное

вздутие почти пустым. Далее, при соприкосновении гифы, в силу ее роста, с

клеткой мезофилла, в гифе возникает, почти у самого края ее, поперечная

перегородка, дающая начало короткой вершинной клетке, которая, таким образом,

является примордием гаустория. После образования этой клетки в нее переходят 2

-3 из имевшихся ядер, 6 ядер остаются в инфицирующей клетке. Примордий

гаустория образует небольшой гаусторий с одним хорошо образованным ядром.

Интересно заметить, что до известного периода, примерно до 6-го дня нет

никаких ни повреждений питающей клетки мезофилла, ни обеднения ее

содержимого; единственное активное воздействие со стороны паразита

заключается в том, что ядро хозяйской клетки, повинуясь стимулу со стороны

внедряющегося паразита, движется к гаусторию, и последний начинает его

обволакивать. После того инфицирующая гифа, несколько задержанная в своем

развитии образованием гаустория, дает 1 – 2 ветви, которые растут и в свою

очередь разветвляются. Вскоре получается богато разветвленная система гиф.

Содержимое клеток паразита перекочевывает к концам гиф.

Спора имеет 2 ядра, аппрессорий - 2 или больше, субстоматальное пузыревидное

вздутие – 8, инфицирующая гифа – после образования первого примордия

гаустория – большей частью 6. При дальнейшем развитии одно или два ядра

остаются у субстоматального пузыря, остальные ядра делятся, и распределяются

по ветвям мицелия. Молодые гифы часто отличаются неправильным распределением

ядер – их бывает 4, чаще – 3. С течением времени число гаусторий

увеличивается и они одноядерны. По периферии инфекционного пятна на листе

располагаются двуядерные клетки, начинают образовываться двуядерные

уредоспоры. В обычном случае судьба диплоида заканчивается закладкой

телиоспор (последние способны прорастать, но про отсутствии промежуточного

хозяина этот отрезок цикла представляется слепым придатком). Для нормального

прорастания заложившихся телиоспор требуется соблюдение определенных условий

– обязательно зимний период покоя с обязательным воздействием на телиоспоры

всех метеорологических условий, свойственных этому времени года (дождя,

мороза и т. д.). Прорастание базидиоспор происходит обычным путем, с

образованием бесцветных базидий и базидиоспор. Для большинства районов Европы

в т. ч. и для Украины единственным путем сохранения ржавчины из года в год

является ее перезимовка в стадии уредо - с последующим заражением злака.

Чередование форм спороношения находится в определенном сочетании с

чередованием фаз развития, т. е. последовательной сменой гаплоида и диплоида.

У ржавчины на долю гаплоида приходятся следующие стадии: базидиоспоры,

мицелий, образующий спермогонии, сами спермогонии со спермациями. На долю

диплоида приходятся эцидии (сформировавшиеся), эцидиоспоры, мицелий,

образующий уредоспоры, уредоспоры, мицелий, образующий телиоспоры и

телиоспоры. Следовательно, начиная с эцидиоспор, все последующие стадии

развития являются представителями диплоидной фазы.

Таким образом, фаза диплоида значительно преобладает над фазой гаплоида, и

только на ней образуются все виды спор, которые служат для размножения и

расселения вида [Гешеле, 1978].

1.2. Специализация и расовый состав

В процессе сопряженной эволюции паразиты строго специализировались к своим

питающим хозяевам – к родам и видам семейств растений [Вавилов, 1986]. Одни

из них специализировались к паразитированию на определенном роде и виде

растений (узкоспециализированные), другие к паразитированию на различных

видах одного или нескольких семейств (широкоспециализированные). В свою

очередь формы состоят из физиологических рас. Генотипы паразита, одинаково

поражающие наборы сортов – диффунциаторов, фитопатологами были приняты за

основу систематической единицы названной ими «физиологическая раса».

Возбудитель бурой листовой ржавчины Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp.

tritici не имеет специализированных форм, в силу узкой специализации вида, и

приходится говорить не о формах, но сразу о физиологических расах бурой

листовой ржавчины [Гешеле, 1979].

Физиологические расы образуются в результате мутаций или рекомбинаций при

половом процессе. Они отличаются одна от другой по наличию генов

вирулентности или их комбинаций, которые могут быть обнаружены по реакции на

растениях-хозяевах. Для анализа рас выделяются моноизоляты, каждый из которых

является потомством одной уредоспоры, состоящим из генетически однородных

биотипов. Расы паразитов определяют с помощью сортовых ключей [Вавилов,

1986].

Первоначально при изучении рас в качестве «тестирующих» были отобраны сорта,

которые вошли в специальные наборы дифференциаторов. Со временем

обнаружилось, что они не могут выявить генетическое разнообразие патогена,

так как не способны охватить всего генетического разнообразия растений-

хозяев. Поэтому к основному набору дифференциаторов добавляют дополнительные

сорта, интересующие селекционеров как доноры устойчивости. Это позволяет

выявить в пределах существующих физиологических рас подрасы (биотипы).

В настоящее время идентифицировано более 200 рас Puccinia recondita Rob ex

Desm f. sp. tritici. [Лесовой, Суворова, 1990]. Специализированные расы

обозначают обыкновенно номерами или буквами. Расы в большинстве случаев

характеризуются определенным географическим ареалом. Состав рас может

меняться из года в год благодаря действию отбора, и возможен занос рас из

других районов [Вавилов, 1986].

Расовый состав Puccinia recondita Rob ex Desm f. sp. tritici, наблюдаемый на

пшенице в степи Украины изучался в Селекционно-генетическом институте. Расы

отличаются частотой встречаемости, вирулентностью – авирулентностью к сортам

и линиям пшеницы с определенными Lr– генами.

До 1996г. доминировала раса 77. В 1997 - 2002 г.г. превалировала раса 144, а

в 2003 – 77 раса бурой листовой ржавчины вновь стала основной.

Из многообразия возникающих в процессе эволюции рас и биотипов более

жизнеспособными оказываются те, которые лучше адаптированы к климатическим

условиям и своим питающим растениям – хозяевам [Бабаянц, 1990].

1.3. Генетические основы устойчивости пшеницы к фитопатогенам.

Селекция сельскохозяйственных культур на устойчивость к возбудителям

инфекционных заболеваний является наиболее актуальной и значимой как наиболее

экономный путь к эффективной защите растений. Вместе с тем экономическая

напряженность в результате интенсивного применения фунгицидов настоятельно

требует широкого внедрения в производство относительно чистых методов борьбы

с болезнями. Среди них возделывание генетически защищенных сортов является

одним из основных. Создание таких сортов – весьма сложное дело, требующее

глубоких знаний о растениях-хозяевах и самих патогенах, закономерностях их

взаимоотношений в зависимости от условий окружающей среды. Наиболее важное

для селекции – представление о генетике устойчивости. Прежде всего,

необходима информация о генах устойчивости, их локализации в хромосомах и

взаимодействии, о наследовании устойчивости и генетическом контроле различных

ее типов. Такая информация позволяет объективно составлять программу

гибридизации и планировать стратегию селекции на иммунитет [Бабаянц, 1990].

1.3.1. Гипотеза Флор «ген на ген»

Растения и возбудители болезней в природе эволюционно тесно связаны и

пригнаны друг другу. Взаимодействие генов растений и паразитов

экспериментально подтвердила американский фитопатолог Флор [Flor, 1956],

выдвинувшая гипотезу «ген на ген». На основе своих исследований Флор сделала

вывод о том, что каждому гену устойчивости или восприимчивости растения-

хозяина соответствует определенный комплементарный ген вирулентности или

авирулентности паразита. Если аллели генов устойчивости и вирулентности

доминантны, то растение устойчиво к болезни. Если же одна из

взаимодействующих аллелей или обе из них находятся в гомозиготном рецессивном

состоянии, то наблюдается восприимчивость к заболеваниям. Исходя из этого,

Флор установила, что гены устойчивости доминантны, а гены вирулентности

рецессивны.

Считают, что в ряде случаев гену устойчивости растения может соответствовать

несколько генов патогенности паразита [Щербаков, 1973]. Возможна обратная

ситуация, когда один ген патогенности соответствует нескольким генам

устойчивости.

Отношения «ген на ген» являются результатом сопряженной эволюции паразита и

растения – хозяина. Длительная совместная эволюция растений – хозяев и

паразитов приводит к развитию взаимной толерантности. Сильно страдающие от

поражения растения не выдерживают конкуренцию с теми, которые страдают

меньше. В результате естественного отбора вид способен повышать свою

выносливость. Генотипы, лучше адаптированные к экологическим условиям среды

оказываются более выносливыми и к поражению болезнями [Гешеле, 1978]. С одной

стороны естественный отбор благоприятствует тем мутациям хозяина, которые

ставят паразита в невыгодное положение. С другой стороны он благоприятствует

тем мутациям паразита, которые усиливают способность паразита к

воспроизводству по сравнению со способностями растения – хозяина. В этом

взаимодействии сначала происходит увеличение частот генов устойчивости, затем

частот генов вирулентности. Последние преодолевают устойчивость хозяина. В

результате такой совместной эволюции между генетическими системами хозяина и

паразита устанавливаются взаимоотношения по принципу «ген на ген».

В процессе эволюции у растений и их паразитов выработались такие механизмы,

которые обеспечивают сохранение генетического материала разнообразия